IPTG (isopropyyli-β-D-tiogalaktosidi) on β-galaktosidaasisubstraatin analogi, joka on erittäin indusoituva.IPTG:n induktion alaisena indusoija voi muodostaa kompleksin repressoriproteiinin kanssa, jolloin repressoriproteiinin konformaatio muuttuu niin, ettei sitä voida yhdistää kohdegeeniin ja kohdegeeni ilmentyy tehokkaasti.Joten miten IPTG:n pitoisuus pitäisi määrittää kokeen aikana?Onko isompi sen parempi?
Ymmärretään ensin IPTG-induktion periaate: E. colin laktoosioperoni (elementti) sisältää kolme rakennegeeniä, Z,Y ja A, jotka koodaavat β-galaktosidaasia, permeaasia ja asetyylitransferaasia, vastaavasti.lacZ hydrolysoi laktoosin glukoosiksi ja galaktoosiksi tai allo-laktoosiksi;lacY päästää ympäristössä olevan laktoosin kulkemaan solukalvon läpi ja pääsemään soluun;lacA siirtää asetyyliryhmän asetyyli-CoA:sta β-galaktosidiin, mikä tarkoittaa myrkyllisen vaikutuksen poistamista.Lisäksi on toimintasekvenssi O, aloitussekvenssi P ja säätelygeeni I. I-geenikoodi on repressoriproteiini, joka voi sitoutua operaattorisekvenssin kohtaan O siten, että operoni (meta) repressoituu ja sammutettu.Sitoutumiskohta kataboliselle geeniaktivaattoriproteiini-CAP-sitoutumispaikalle on myös ylävirtaan aloitussekvenssistä P. P-sekvenssi, O-sekvenssi ja CAP-sitoutumiskohta muodostavat yhdessä lac-operonin säätelyalueen.Kolmen entsyymin koodaavia geenejä säätelee sama säätelyalue geenituotteiden koordinoidun ilmentymisen saavuttamiseksi.
Laktoosin puuttuessa lac-operoni (meta) on tukahdutettuna.Tällä hetkellä lac-repressori, jota I-sekvenssi ekspressoi PI-promoottorisekvenssin ohjauksessa, sitoutuu O-sekvenssiin, mikä estää RNA-polymeraasia sitoutumasta P-sekvenssiin ja estää transkription aloituksen;kun laktoosia on läsnä, lac-operoni (meta) voidaan indusoida Tässä operoni (meta) järjestelmässä todellinen indusoija ei ole laktoosi itse.Laktoosi pääsee soluun ja β-galaktosidaasi katalysoi sen muuttumaan allolaktoosiksi.Jälkimmäinen indusoijamolekyylinä sitoutuu repressoriproteiiniin ja muuttaa proteiinin konformaatiota, mikä johtaa repressoriproteiinin dissosioitumiseen O-sekvenssistä ja transkriptioon.Isopropyylitiogalaktosidilla (IPTG) on sama vaikutus kuin allolaktoosilla.Se on erittäin tehokas induktori, jota bakteerit eivät metaboloi ja on erittäin stabiili, joten sitä käytetään laajasti laboratorioissa.
Kuinka määrittää IPTG:n optimaalinen pitoisuus?Otetaan esimerkkinä E. coli.
Geneettisesti muokattu E. coli BL21 -kanta, joka sisälsi positiivisen rekombinantin pGEX:n (CGRP/msCT), siirrostettiin nestemäiseen LB-elatusaineeseen, joka sisälsi 50 µg·mL-1 Amp, ja viljeltiin yön yli 37 °C:ssa.Yllä oleva viljelmä siirrostettiin 10 pulloon 50 ml tuoretta nestemäistä LB-elatusainetta, joka sisälsi 50 µg·ml-1 Amp suhteessa 1:100 ekspansioviljelmää varten, ja kun OD600-arvo oli 0,6-0,8, IPTG lisättiin lopulliseen pitoisuuteen.Se on 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Induktion jälkeen samassa lämpötilassa ja samaan aikaan siitä otettiin 1 ml bakteeriliuosta ja bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla ja alistettiin SDS-PAGE:lle erilaisten IPTG-pitoisuuksien vaikutuksen analysoimiseksi proteiinin ilmentymiseen. valitse IPTG-pitoisuus, jolla on suurin proteiiniekspressio.
Kokeiden jälkeen havaitaan, että IPTG:n pitoisuus ei ole niin suuri kuin mahdollista.Tämä johtuu siitä, että IPTG:llä on tietty myrkyllisyys bakteereille.Konsentraation ylittäminen tappaa myös solun;ja yleisesti ottaen toivomme, että mitä liukoisempaa proteiinia solussa ilmentyy, sitä parempi, mutta monissa tapauksissa, kun IPTG:n pitoisuus on liian korkea, muodostuu suuri määrä inkluusiota.Keho, mutta liukoisen proteiinin määrä väheni.Siksi sopivin IPTG-pitoisuus ei useinkaan ole sitä suurempi, sitä parempi, mutta mitä pienempi pitoisuus.
Geenimuunneltujen kantojen induktion ja viljelyn tarkoituksena on lisätä kohdeproteiinin saantoa ja alentaa kustannuksia.Kohdegeenin ilmentymiseen eivät vaikuta ainoastaan kannan omat tekijät ja ilmentämisplasmidi, vaan myös muut ulkoiset olosuhteet, kuten indusoijan pitoisuus, induktiolämpötila ja induktioaika.Siksi yleensä, ennen kuin tuntematon proteiini ekspressoidaan ja puhdistetaan, on parasta tutkia induktioaikaa, lämpötilaa ja IPTG-konsentraatiota, jotta voidaan valita sopivat olosuhteet ja saada parhaat koetulokset.
Postitusaika: 31.12.2021