IPTG (isopropyyli-β-D-tiogalaktosidi) on β-galaktosidaasin substraatin analogi, joka on erittäin indusoitava. IPTG:n induktion vaikutuksesta indusoija voi muodostaa kompleksin repressoriproteiinin kanssa, jolloin repressoriproteiinin konformaatio muuttuu niin, ettei se voi yhdistyä kohdegeeniin ja kohdegeeni ilmentyy tehokkaasti. Miten IPTG:n pitoisuus tulisi siis määrittää kokeen aikana? Onko mitä suurempi, sen parempi?
Ensin ymmärretään IPTG-induktion periaate: E. colin laktoosioperoni (elementti) sisältää kolme rakennegeeniä, Z, Y ja A, jotka koodaavat vastaavasti β-galaktosidaasia, permeaasia ja asetyylitransferaasia. lacZ hydrolysoi laktoosin glukoosiksi ja galaktoosiksi eli allo-laktoosiksi; lacY sallii laktoosin kulkeutua solukalvon läpi ja päästä soluun; lacA siirtää asetyyliryhmän asetyyli-CoA:sta β-galaktosidiin, mikä poistaa toksisen vaikutuksen. Lisäksi on olemassa operatiivinen sekvenssi O, aloitussekvenssi P ja säätelygeeni I. I-geenin koodi on repressoriproteiini, joka voi sitoutua operaattorisekvenssin O-asemaan, jolloin operoni (meta) repressoituu ja sammuu. Aloitussekvenssin P yläpuolella on myös sitoutumiskohta katabolisen geenin aktivaattoriproteiinin ja CAP:n sitoutumiskohtalle. P-sekvenssi, O-sekvenssi ja CAP:n sitoutumiskohta muodostavat yhdessä lac-operonin säätelyalueen. Kolmen entsyymin koodaavia geenejä säätelee sama säätelyalue geenituotteiden koordinoidun ilmentymisen saavuttamiseksi.
Laktoosin puuttuessa lac-operoni (meta) on repressiotilassa. Tällöin I-sekvenssin PI-promoottorisekvenssin säätelemä lac-repressori sitoutuu O-sekvenssiin, mikä estää RNA-polymeraasia sitoutumasta P-sekvenssiin ja estää transkription aloituksen; laktoosin läsnä ollessa lac-operoni (meta) voi indusoitua. Tässä operoni(meta)järjestelmässä todellinen indusoija ei ole itse laktoosi. Laktoosi pääsee soluun ja β-galaktosidaasi katalysoi sen muuntumaan allolaktoosiksi. Jälkimmäinen indusoijamolekyylinä sitoutuu repressoriproteiiniin ja muuttaa proteiinin konformaatiota, mikä johtaa repressoriproteiinin irtoamiseen O-sekvenssistä ja transkriptioon. Isopropyylitiogalaktosidilla (IPTG) on sama vaikutus kuin allolaktoosilla. Se on erittäin voimakas indusoija, jota bakteerit eivät metaboloi ja joka on erittäin stabiili, joten sitä käytetään laajalti laboratorioissa.
Miten IPTG:n optimaalinen pitoisuus määritetään? Otetaan esimerkiksi E. coli.
Positiivisen rekombinantti-pGEX:n (CGRP/msCT) sisältävä geenimuunneltu E. coli BL21 -kanta inokuloitiin 50 μg·ml-1 Amp:tä sisältävään LB-nestemäiseen kasvatusalustaan ja viljeltiin yön yli 37 °C:ssa. Yllä oleva viljelmä inokuloitiin 10 pulloon, joissa oli 50 ml tuoretta LB-nestemäistä kasvatusalustaa, jotka sisälsivät 50 μg·ml-1 Amp:tä suhteessa 1:100 laajennusviljelyä varten. Kun OD600-arvo oli 0,6–0,8, IPTG:tä lisättiin lopulliseen pitoisuuteen. Se on 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·l-1. Samassa lämpötilassa ja samaan aikaan tapahtuneen induktion jälkeen bakteeriliuoksesta otettiin 1 ml, ja bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla ja niille tehtiin SDS-PAGE, jotta analysoitiin eri IPTG-pitoisuuksien vaikutusta proteiinien ilmentymiseen ja sitten valittiin IPTG-pitoisuus, jolla on suurin proteiinien ilmentyminen.
Kokeiden jälkeen havaitaan, että IPTG:n pitoisuus ei ole mahdollisimman suuri. Tämä johtuu siitä, että IPTG:llä on tietty myrkyllisyys bakteereille. Pitoisuuden ylittäminen tappaa myös solun. Yleisesti ottaen toivomme, että mitä enemmän solussa ilmentyy liukoista proteiinia, sitä parempi. Mutta monissa tapauksissa, kun IPTG:n pitoisuus on liian korkea, muodostuu suuri määrä inkluusiota. Keho, mutta liukoisen proteiinin määrä vähenee. Siksi sopivin IPTG-pitoisuus ei usein ole "mitä suurempi, sitä parempi", vaan "mitä pienempi pitoisuus".
Geneettisesti muunneltujen kantojen induktion ja viljelyn tarkoituksena on lisätä kohdeproteiinin saantoa ja vähentää kustannuksia. Kohdegeenin ilmentymiseen vaikuttavat paitsi kannan omat tekijät ja ilmentämisplasmidi, myös muut ulkoiset olosuhteet, kuten indusoijan pitoisuus, induktiolämpötila ja induktioaika. Siksi yleensä ennen tuntemattoman proteiinin ilmentämistä ja puhdistamista on parasta tutkia induktioaika, lämpötila ja IPTG-pitoisuus sopivien olosuhteiden valitsemiseksi ja parhaiden kokeellisten tulosten saamiseksi.
Julkaisun aika: 31.12.2021