Ditiotreitoli (DTT) on yleisesti käytetty pelkistin, joka tunnetaan myös nimellä uusi vihreä lisäaine. Se on pienimolekyylinen orgaaninen yhdiste, jossa on kaksi merkaptaaniryhmää (-SH). Pelkistävien ominaisuuksiensa ja stabiiliutensa ansiosta DTT:tä käytetään laajalti biokemian ja molekyylibiologian kokeissa.
DTT:n päätehtävänä on vähentää disulfidisidoksia proteiineissa ja muissa biomolekyyleissä. Disulfidisidos on tärkeä osa proteiinin laskostumista ja stabiilisuutta, mutta tietyissä kokeellisissa olosuhteissa, kuten pelkistettävässä SDS-PAGE-analyysissä, proteiinin rekombinaatiossa ja laskostumisessa, on välttämätöntä pelkistää disulfidisidos kahdeksi tioliryhmäksi proteiinin spatiaalisen rakenteen purkamiseksi. DTT voi reagoida disulfidisidosten kanssa pelkistäen ne merkaptaaniryhmiksi, mikä avaa proteiinin spatiaalisen rakenteen ja helpottaa sen analysointia ja manipulointia.
DTT:tä voidaan käyttää myös entsyymiaktiivisuuden ja -stabiilisuuden suojaamiseen. Joissakin entsyymikatalysoiduissa reaktioissa hapetin voi vähentää entsyymin aktiivisuutta. DTT voi reagoida hapettimien kanssa ja pelkistää ne vaarattomiksi aineiksi, mikä suojaa entsyymin aktiivisuutta ja stabiilisuutta.
Verrattuna perinteisiin pelkistimiin, kuten β-merkaptoetanoliin (β-ME), DTT:tä pidetään turvallisempana ja vakaampana pelkistimenä. Se ei ole ainoastaan stabiili vesiliuoksessa, vaan säilyttää myös pelkistävät ominaisuutensa korkeissa lämpötiloissa ja happo-emäsolosuhteissa.
DTT:n käyttö on suhteellisen yksinkertaista. Yleensä DTT liuotetaan sopivaan puskuriin ja lisätään sitten koejärjestelmään. DTT:n optimaalinen pitoisuus on määritettävä kokeen mukaan, ja sitä käytetään yleensä välillä 0,1–1 mM. Pienemmät pitoisuudet voivat vähentää haitallisia vaikutuksia solujen kasvuun ja kohdeproteiinien yliekspressiosta johtuvaa sytotoksisuutta. Suuremmat pitoisuudet voivat aiheuttaa liiallista solujen aineenvaihduntataakkaa, mikä vaikuttaa solujen kasvuun ja ilmentymistehokkuuteen.
Optimaalisen pitoisuuden määrittämiseen voidaan käyttää kohdeproteiinin ilmentymistason arviointia suorittamalla IPTG-induktiotestejä eri pitoisuuksilla. Pienimuotoisia viljelytestejä voidaan suorittaa käyttämällä erilaisia IPTG-pitoisuuksia (esim. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM jne.), ja ilmentymisvaikutus eri pitoisuuksilla voidaan arvioida havaitsemalla kohdeproteiinin ilmentymistaso (esim. Western blot tai fluoresenssidetektio). Kokeellisten tulosten perusteella optimaaliseksi pitoisuudeksi valittiin pitoisuus, jolla on paras ilmentymisvaikutus.
Lisäksi voit viitata asiaankuuluvaan kirjallisuuteen tai muiden laboratorioiden kokemuksiin ymmärtääksesi yleisesti käytetyn IPTG-pitoisuusalueen samankaltaisissa koeolosuhteissa ja optimoida ja säätää sitä sitten kokeellisten tarpeiden mukaan.
On tärkeää huomata, että optimaalinen pitoisuus voi vaihdella eri ilmentämisjärjestelmien, kohdeproteiinien ja koeolosuhteiden mukaan, joten on parasta optimoida tapauskohtaisesti.
Yhteenvetona voidaan todeta, että DTT on yleisesti käytetty pelkistävä aine, jota voidaan käyttää disulfidisidosten pelkistämiseen proteiineissa ja muissa biomolekyyleissä sekä entsyymien aktiivisuuden ja stabiilisuuden suojaamiseen. Sitä on käytetty laajalti biokemian ja molekyylibiologian kokeissa.
Julkaisun aika: 28.9.2023